据报道,全球每年有018 ～1 亿DF 和25 ～50 万DHF 患者,其中约有5 000 人由于DHF/ DSS 而死亡。目前,仅靠控制蚊媒的传播来预防登革热的流行,安全有效的登革疫苗仍处于实验阶段。过去50 多年来,国内外学者对登革疫苗作了大量的研究,取得了一些令人振奋的成果。本文仅对近年来登革疫苗的研究进展及动物模型的构建作一综述。
1 　灭活疫苗
多数登革病毒株在细胞中生长缓慢,滴度低。因此,研制登革的全病毒灭活疫苗较为困难。近年来随着组织培养技术的发展,登革病毒的灭活疫苗已取得一定的突破。
Putnak以FRhL22 和Vero 细胞的DEN2 适应株16681 和S16803 感染细胞后,所收集上清产生高滴度病毒(达107～108) ,经甲醛灭活,在鼠中均可诱导高效价的中和、HI 抗体。免疫猴后,可耐受高达104pfu 的病毒攻击。同时,病毒血症存在的时间大大降低。Putnak 的研究为其它3 个型的疫苗研究奠定了基础,也使得多价登革灭活疫苗的研制成为可能。
2 　减毒活疫苗
早期研究中只有DEN22 PR2159 S1株进入Ⅰ期临床,但该侯选疫苗株尚未推广使用。现在报道的登革减毒株很多,其中泰国Mahidol 大学研制的四个型的减毒株DEN 1 PDK13 、DEN22 PDK53 、DEN23 PGMK30F3 和DEN24PDK48 ,比较成功。PDK53 免疫猴,完全被保护,以DEN2 病毒攻击,血清中无病毒及其RNA 检出。该减毒株皮下接种10 名无黄病毒免疫史的美国志愿者,所有受试者均产生中和抗体,且可持续2 年。临床实验表明,Mahidol 大学研制的单价和多价减毒疫苗对成人均具有极高的安全性和极强的免疫原性。儿童受试者约有95 %对一种血清型产生中和抗体,对4种血清型产生中和抗体的也高达80 %。近来实验表明,儿童以四价疫苗免疫1 次,80 %的受试者产生4 个型的中和抗体,而在6～12 个月后加强免疫一次,比例则可达89 %。
人体实验中,PDK13 的免疫效果要弱于其它3个型别的减毒株,因此,对于登革1 型病毒而言,其单价减毒疫苗仍需进一步研究。
3 　亚单位疫苗
在登革病毒基因组编码的10 种蛋白中,主要对E 和NS1 进行了研究。
E 具有多种抗原表位,能诱导产生H Ⅰ抗体和中和抗体,同时也与病毒的感染有关。Velzing以重组E 蛋白免疫猴,发现不能使猴完全免受病毒攻击,这可能与重组E 蛋白和天然E 蛋白的构象差异有关。研究表明,黄病毒E 蛋白的第71～72 、128 、224～227 、270 、303～311 、333 、402～403 氨基酸周围区域(这些位点/ 区域位于E 的Ⅰ、Ⅱ区) 对病毒与宿主细胞膜的结合/ 融合极为重要。因此,在设计E 的亚单位疫苗时,必须保证这些位点/ 区域的完整,以维持各种表位的天然构象。
DHF 与抗体依赖性感染增强(ADE ,Antibodydependent enhancement ) 有关。结构蛋白的中和抗体可保护机体免受同型病毒的攻击,但亚中和水平也可促进感染。为克服ADE ,人们将目光转向非结构蛋白(NS) 。NS1 是最强的免疫原,存在于感染细胞的细胞膜及培养液中,以抗体介导的细胞毒或补体激活来破坏感染细胞。Schlesinger和同事第一次证实NS1 可保护小鼠免受DEN2 的感染,同时J yh 等以合成的DEN2 NS12P1 (aal～15) 作为免疫原检测DF、DHF 病人血清,发现4 个型的登革病毒抗血清均可与DEN2 NS12P1 反应, 约45 %的DF、DHF 有抗DEN2 NS12P1 的抗体。
可见,NS1 是极好的亚单位疫苗侯选株,它诱导的抗体与抗E 抗体无交叉反应,且无Fc 介导的免疫增强作用,但要注意寡聚体分子的稳定性。
由于病毒的亚单位蛋白分离困难,不易纯化,因此,多采用重组亚单位疫苗。目前,应用较多的载体有大肠杆菌、杆状病毒、甲病毒等,痘苗病毒载体由于有一定的副作用,现已很少用。
3.1 　大肠杆菌
Fonseca在E. Coli 中将E 的B 区与t rp E 融合表达,表达的融合蛋白与同型的超免疫腹水有极强的反应性,与异型血清型抗体无反应,但该蛋白在鼠中无免疫原性,而Simmons将B 区与MBP 融合表达后发现,该表达蛋白与抗体的反应结果与Fonseca 相同,但它能保护80 %的鼠免受病毒的攻击。这可能是因为B 区多肽与MBP 融合表达时,其构象更接近天然构象的缘故。由于原核系统的表达蛋白不能被糖基化,而且蛋白多以包涵体形式存在,限制了它作为疫苗抗原的应用。现在,多采用真核表达系统。
3.2 　杆状病毒
Ohmann在杆状病毒中表达DEN2 、DEN3的杂交E 蛋白(DEN2E 的N 端2/ 3 和DEN3E 的C端1/ 3) rD2D3E ,表达蛋白构象完整,能与登革病毒特异性抗血清反应,体外能抑制DEN2 、DEN3 与人骨髓单核细胞结合, 在远交鼠中能诱导DEN2 、DEN3 的抗体和T 细胞应答。这种杂交蛋白是一种潜在的疫苗,若构建成功rD1D4E ,则可进一步构建登革病毒的4 价疫苗。
3.3 　甲病毒
甲病毒具有宿主范围广和致病性低等特点,在动物病毒疫苗的研制方面极有应用前景。目前,已有MVE、J EV、L IV 的重组甲病毒免疫动物的报道,在动物实验中能使动物免受原型病毒的攻击。本实验室于曼等构建的含我国登革2 型病毒43 株的PrM 基因的重组甲病毒颗粒,在体外试验中对同型的登革病毒攻击具有保护作用,目前正准备对其体内免疫效果进行研究。
4 　新型疫苗
4.1 　cDNA 疫苗
全长感染性cDNA 已有DEN2 的N GC 株、16681 株和PDK53 株、DEN24 的814669 株等构建成功。cDNA 转录成RNA 后,转染细胞即可产生子代病毒。与登革病毒的减毒株相比,此系统可稳定疫苗株的遗传构成,不易产生变异株。
登革病毒的5′端大在约100 nt 和3′端的400～600 nt 为非编码区,在病毒的翻译、复制和包装中具有重要作用。5′端非编码区形成二级结构,影响该二级结构的突变会影响RNA2蛋白的相互作用,影响病毒毒力,导致减毒。RNA 的5′端非编码区的环(loop) 或短茎缺失时,病毒通常具有感染性,而长茎区缺失对病毒而言则是致命的。Cahour对DEN4 5′端非编码区进行缺失突变,在11 个突变株中,筛选到1 株对病毒RNA 的翻译影响极小(可达野生型的25 %) 。突变体RNA 转染LLC2MK2 ,获得具有感染性的子代病毒,该病毒在C6/ 36 上产生小噬斑,胸内接种埃及伊蚊和白蚊、伊蚊,病毒不复制。3′端非编码区最后90～100 nt 形成稳定的二级结构,Men在该二级结构上的上游区进行一系列的缺失突变发现,缺失303～183 nt 的突变体无生长限制性,产生高滴度的病毒。恒河猴实验表明,该突变体诱导的抗体反应与野生型病毒相当,而其它突变体诱导的抗体水平极低或只有中等水平。上述突变体均是可能的疫苗侯选株,值得进行深入研究。
除了5′端和3′端的基因缺失会影响病毒毒力外,E、PreM 和NS1 上的一些位点突变也会影响毒力。因此,通过定点诱变构建具有感染性的全长cDNA ,将是获得减毒档的一种高效的方法。但首先必须找到毒力相关位点,研究发现,病毒在减毒过程中,核苷酸会发生突变,因此,比较减毒株和亲代株的全序,可以找出这这些毒力位点。
总结cDNA 疫苗研究情况发现,将病毒的5′、3′端非编码区有部分核苷酸缺失、且减毒突变子,进行定点诱变,去除其毒力位点,将会获得高度减毒,且大大降低其回复率的减毒株。这将是以后登革病毒cDNA 疫苗研究的主要方向。
4.2 　嵌合体疫苗
嵌合体是一种新型的登革活疫苗。不同型别病毒的蛋白结合、导致异源蛋白2蛋白或蛋白2RNA 的相互作用,这种作用不利于病毒的复制,导致减毒。构建的DEN1/ DEN4 (表达DEN1 的C2PrM2E) 感染猴后,大多数产生中和抗体,而DEN2/ DEN4 (表达DEN2 的PrM2E) 则都产生抗体。以同型病毒攻击后,接种DEN2/ DEN4 的所有猴均免于病毒血症,而接种DEN1/ DEN4 的只有75 %得到保护。以DEN1/ DEN4 、DEN2/ DEN4 的及双价嵌合体免疫猴,均产生针对DEN1 、、DEN2 的中和抗体,并免受病毒攻击。研究表明,嵌合体病毒比亲代株的复制效率低,可能与DEN4 的非结构蛋白和异型病毒的结构蛋白形成的嵌合体的基因修饰有关。
将嵌合的结构基因的毒力位点进行突变,亦可减毒。Chen把DEN3 的Glu406置换成Lys ,构建的DEN3/ DEN4 在乳鼠中具有神经毒力,而野生型嵌合体,亲代DEN3 则无神经毒力。
如果将登革病毒减毒株的cDNA (如PDK53、PDK48 等) 作为减毒载体,构建嵌合体疫苗,极有应用前景。Huang等以PDK53 为骨架构建的DEN1(16007) / PDK53 仍具有减毒标志:在LLC2MK(2) 细胞保持小空斑和温度敏感性、在C6/ 36 细胞中复制效率底,鼠中可减毒。同时该嵌合体可使鼠产生DEN1的高滴度中和抗体、滴度远远大于PDK13 和嵌合体PDK13/ PDK53。在泰国Mahidol 大学研制的4 型登革减毒株中,PDK13 效率最低,因此,DEN1 (16007) /PDK53 是DEN1 的潜在侯选株。
若将病毒cDNA 的5′、3′非编码区部分核苷酸缺失的减毒突变体作为载体,则会极大提高其安全性。
4.3 　DNA 疫苗
DNA 疫苗是近年来由基因治疗衍生并发展起来的一种新的疫苗研究领域,现已成为病毒疫苗研究的热点。目前,流行性乙型脑炎病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、狂犬病毒、艾滋病毒、呼吸道合胞病毒等多种病毒均已进行过DNA 疫苗的研究。但登革病毒DNA 疫苗的研究很少。
Kochel 等于1997 年构建了第1 个含DEN2 病毒PrM2E 基因的DNA 疫苗,皮下接种BALB/ c鼠后发现,所有鼠均产生中和抗体,但对病毒攻击却无保护作用。随后, Proter又对疫苗株p1012D2ME 作了进一步的研究。他发现, PUC19中的Cp G可提高抗体应答水平,但在攻击模型中,实验组(DNA + PUC19) 仅有60 %的小鼠得到保护。该DNA 疫苗的保护效率不高,可能与CTL 应答水平太低有关: ①DNA 疫苗只有肌肉接种才适于诱导Th1 应答(该应答诱导CTL) ; ②CTLS 表位可能位于C 区,而不是PreM 或者E 区。
DNA 疫苗除可诱导中和抗体外,也可诱导B 细胞记忆应答, Koneshi证实接种pcD2ME 的小鼠在受到病毒攻击后的第8 天,中和抗体滴度大大提高,达到1∶80 以上(攻击前仅为1∶10) 。
本实验室也对登革病毒的DNA 疫苗作了研究。仝莉莉等将我国登革2 型43 株的PrM 和9718 %E 蛋白的编码序列克隆到pBK2CMV 中,构建的重组质粒pBK2CMV2ME DNA 不但可诱导小鼠产生特异性抗体,而且此抗体持续时间长,在末次免疫后25 天仍可检测到。由于作者未对DNA的细胞免疫和病毒攻击进行研究,其综合效果尚难以确定。这是目前我国构建的第1 个登革病毒的DNA 疫苗。随后,胡志君等发现,构建的重组质粒pcDNA2NS1 DNA 不但可诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答,而且在病毒攻击实验中,有9019 %的小鼠得到保护。
DNA 疫苗制备工艺简单,生产成本低,是登革病毒潜在的疫苗侯选株,下一步,应加强DNA 在非人灵长类动物中的免疫效果观察,为进行临床研究奠定基础。
5 　动物模型
缺乏合适的小动物模型是研制登革疫苗的一大障碍。猴已用于人的减毒活疫苗的筛选,但真正可用于疫苗检测和致病机理研究的小动物模型仍未出现。近来研究发现,登革病毒可在人肝癌细胞系Hep G2 (Human hepatovarcinoma cell line) 中复制,并释放感染性病毒颗粒。依此,An等将Hep G2 植入不产生功能性T、B 细胞,并且缺少Ig 的SCID(Severe combined immunodeficient) 鼠,经腹腔感染DEN2 病毒后,在肝、血清和脑神经元中均可检测到病毒。临床检查证明与人类感染在临床、病理组织学和病毒学方面极其相似。
IFN2α、β、γ与人抗病毒有关,外源IFN 注入小鼠,可使其免受登革病毒的攻击。因此,另外一种构建动物模型的方法就是使小鼠缺失IFN2α、β、γ受体基因,Alison据此构建了AG129 鼠,腹腔注射鼠适应的DEN2 病毒,鼠均死亡,而登革病毒的多克隆抗体可使鼠受到保护、存活时间延长。
虽然尚不知这些动物模型是否可用于其它血清型,也不知它们是否可模拟DHF/ DSS ,但随着这些模型的进一步完善,它们一定会给登革疫苗的研制提供极大的便利。
6 　结语
登革疫苗的研究已有50 多年,但至今仍无有效的疫苗用于临床。传统的灭活疫苗虽已取得一定的进展,但由于难度大,仍需继续研究;以细胞或乳鼠传代获得减毒疫苗的经典做法则已显得过时。分子生物学技术的发展,给新型登革疫苗研制提供了广阔的舞台。随着动物模型和多价疫苗定量系统的成熟和完善,势必会加快登革疫苗的研究进程。
来源：微生物学免疫学进展2001 年第29 卷第1 期  ( 陈水平综述,秦鄂德审校   军事医学科学院微生物流行病研究所,北京　100850)